Conformation intrinsèque et induite de l’ADN La conformation de l’ADN résulte de la géométrie de chaque paire de bases et des contraintes d’empilement des paires de bases successives. Leur répétition par rapport à la périodicité de la double hélice définit la géométrie de la chaîne d’ADN dans l’espace. Ainsi une répétition de suite d’adénines toutes les 10 et 11bp génère une courbure de l’ADN dans le plan. La microscopie électronique permet d’établir des cartes de courbure sur des grands fragments d’ADN. Chaque molécule est digitalisée et la courbure est calculée dans des fenêtres de 150 pb (50 nm), déplacées avec des pas de 30 pb le long du fragment préalablement orienté par un complexe streptavidine ferritine ou associé en dimères parfaitement symétriques. Des cartes de courbure sont ainsi obtenues à partir du traitement statistique de séries de 500 à 1000 molécules. Pour caractériser simultanément courbure et flexibilité locales, nous avons développé une stratégie dite « petit fragment » où nous insérons au centre l’évènement d’intérêt (séquences particulières, sites abasiques, nick…). L’angle au centre est mesuré sur des séries de 1000 molécules; la courbure et la flexibilité locales sont alors déterminées grâce à un modèle de gaussienne repliée . Cette approche peut être utilisée pour l’étude de complexes ADN-protéines

Exemple du rôle de la conformation de l’ADN sur l’assemblage des complexes nucléoprotéiques : la protéine LrpC

La protéine LrpC régule son propre promoteur en se fixant dans une région de forte courbure. L’ADN s’enroule autour d’un oligomère de LrpC pour former une structure proche de celle du nucléosome avec un rayon de courbure de 4.5 nm. LrpC polymérise le long de l’ADN et forme un complexe stable dans une région courbe contenant des motifs CAAAA (Junction model). LrpC ne forme pas de complexe avec de l’ADN courbe d’une autre nature (Wedge model). Lrp est très conservée dans l’évolution chez les procaryotes. Comme LrpA, LrpC forme un octamère, tétramère de dimères qui enroule l’ADN lors de l’interaction. La courbure permet la formation des complexes. Si les motifs CAAAA ne sont pas en phase avec le pas de l’hélice (ADN non courbe) alors la polymérisation et les interactions protéines-protéines forment des réseaux d’une autre nature. Ainsi la conformation de l’ADN détermine la nature de l’assemblage de LrpC sur l’ADN. LrpC génère du superenroulement positif en enroulant l’ADN dans une hélice droite, contrairement au nucléosome.

L'intégrité du matériel génétique présent dans toute la cellule vivante est continuellement remise en cause par une variété d'agents génotoxiques d'origine exogène (rayonnements solaires ou ionisants, cancérogènes chimiques, médicaments, polluants), ou endogène (instabilité chimique des bases, radicaux oxygène. Les systèmes de réparation par excision de nucléotide (NER) et excision de base (BER) sont majoritairement utilisés dans la cellule pour détecter et réparer ces lésions. Le système NER répare essentiellement les lésions issues d’agents exogènes alors que le système BER est utilisé presque exclusivement dans la réparation des lésions d’origine endogène. Pour l’étude du système NER nous avons sélectionné les deux produits majoritairement formés lors de l’irradiation de l’ADN par les ultra-violets : les adduits dits "cyclobutaniques", majoritaires, résultant d'une réaction de cycloaddition entre les deux doubles liaisons C5C6 des bases pyrimidiniques adjacentes et les adduits dits "bipyrimidines (6-4)" qui résultent de l'ouverture d'un intermédiaire instable de type oxétane ou azétidine produit par cycloaddition entre la double liaison C5C6 de la pyrimidine en 5' et le carbonyle d'une thymine ou l'imine d'une cytosine en 3'. Pour l’étude du système BER nous avons sélectionné le site abasique, produit intermédiaire de la réparation.

Les propriétés structurales des ces lésions seront étudiées par les approches biochimiques classiques et par microscopies électronique et de force atomique afin de déterminer les propriétés statiques (courbure) et dynamiques (flexibilité et réponse mécanique) des lésions. Ces études sont réalisées sur des systèmes simples binaires (une lésion, une protéine) et sur des systèmes plus complexes faisant intervenir plusieurs protéines, en particulier XPA/RPA, DNA glycosylase, APE1 endonucléase, TFIIH, PARP I et II, XRCC1, DNA ligaseIII et DNA Pol dans ces systèmes BER et NER. Enfin nous étudions également le rôle de la chromatine dans ces mécanismes d’assemblage et de remodelage.

La réparation des cassures doubles brins repose sur deux systèmes principaux : la recombinaison homologue qui utilise une séquence d'ADN identique à la séquence endommagée comme matrice pour la réparation et le NHEJ (non-homologous end-joining) qui correspond à une simple ligature des extrémités d'ADN cassées. Le système NHEJ intervient dans les cassures double brin et procède par simple ligature des extrémités d'ADN par un processus de religation. Cette étape de réparation a pour acteur le complexe Ku/DNA-PK qui permet de reconnaître les cassures doubles brins et les réassocier afin de procéder à la ligation. Dans cette réaction d’assemblage, c’est l’hétérodimère Ku (86/70) qui recrute la sous unité catalytique DNA-PKcs, mais Ku a bien d’autres fonctions qui restent a comprendre. Nous nous intéressons aux mécanismes de reconnaissance des lésions par Ku, en particulier par des mécanismes de polymérisation le long de l’ADN.

La recombinaison homologue constitue un mécanisme de réparation des cassures simple et doubles brins et joue un rôle important dans la réplication, notamment pour la reprise de la synthèse après blocage de la fourche par des lésions sur l’ADN. Elle est essentielle à la stabilité du génome, mais peut être potentiellement toxique par les intermédiaires qu’elle génère ou par les réarrangements de l’information génétique qu’elle produit et qui peuvent être nuisibles à la cellule. Ce processus nécessite donc un mécanisme de contrôle susceptible de bloquer la recombinaison homologue, en cas de formation d’intermédiaires potentiellement dangereux. Nous avons montré que l’hélicase Srs2 régule négativement la recombinaison homologue en déstabilisant les nucléofilaments présynaptiques Rad51–ssADN. Par ailleurs l'activité hélicase de Srs2 est peu connue et son rôle ignoré. Nous travaillons à mieux caractériser cette activité: processivité, vitesse de déroulement, effets de la présence de protéines sur l’ADN, arrêt éventuel et rechargement de l’hélicase.

Pour caractériser les complexes nucléoprotéiques, en terme de cinétique d’assemblage et de structures tridimensionnelles, nous développons la cryomicroscopie et l’analyse d’images de l’ADN et des complexes associés. La cryomicroscopie électronique repose sur l’observation d’objets biologiques hydratés et congelés, proches de leur état natif en solution. Couplée à des techniques d’analyse d’images, elle permet d’obtenir des informations structurales avec une résolution de 7 à 30 Å.
La cryomicroscopie électronique utilise un mode de préparation des molécules très spécifique: celles-ci, en suspension dans un film liquide d’une centaine de nm d’épaisseur, sont immobilisées par une congélation ultra-rapide qui transforme le solvant aqueux en un film de glace amorphe, ce qui autorise avec un porte-objet refroidi à l’azote liquide, l’obtention d’images stéréoscopiques des molécules figées dans la glace, sans contrastant ni film support. La procédure classique d’acquisition d’images permet une reconstruction 3D à partir de deux images d’un même objet obtenu sous différents angles (15°) dans des conditions d’éclairement à faible dose. Ceci, appliqué à l’ADN, permet de visualiser la géométrie dans l’espace des molécules, et d’en calculer les conformations, générale et locale, avec une très grande précision. Appliquée aux complexes nucléoprotéiques, elle permet d’une part de définir les architectures des complexes, mais aussi les étapes assemblages en réalisant des cinétiques rapides. Nous développons actuellement un cryoplongeur associé à un mélangeur rapide pour nous permettre de réaliser des incubations à des temps très courts, au moins dans des échelles de temps de l’ordre de la seconde.

Reconstruction tridimensionnelle d’une moélcule d’ADN à partir de deux images tiltées  15°.

Pour étudier ces complexes nucléoprotéiques impliquées dans la maintenance de l’ADN il est nécessaire de développer des techniques résolutives dans l’espace comme dans le temps qui permettent de déterminer les aspects structuraux et la dynamique des interactions ADN-protéines. Les développements de la microscopie à force atomique (AFM) offrent la possibilité d’étudier ces différentes propriétés de l’ADN en milieu liquide, sur des molécules d’ADN uniques attachées à la surface d’un substrat en des points fixes et contrôlés.
Nous développons de nouvelles approches techniques pour mieux appréhender la dynamique des complexes nucléoprotéiques en liquide, leur assemblage et leur remodelage sous l’action de moteurs moléculaires comme les hélicases.
L’approche méthodologique nécessite d’une part de poursuivre la rationalisation de l’adsorption des molécules d’ADN nues en des points fixes et contrôlés sur différents types de surfaces et compatibles avec les conditions d’étude en liquide, et d’autre part d’étudier l’influence de la surface sur la formation des complexes nucléoprotéiques. Cette recherche rassemble des compétences et des techniques expérimentales issues de la chimie, de la physique, et de l’instrumentation.
Les méthodes choisies pour immobiliser l’ADN sur la surface doivent lui permettre de conserver son activité biologique et de rester accessible aux protéines, ce qui implique une fixation légère. Cependant, elles doivent aussi permettre l’observation par AFM en milieu liquide qui oblige une fixation plus forte.